Überleben von SARS - Pet Wipes Group Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 10624 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Aerosole oder Speichel, die das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) enthalten, können Wohnumgebungen kontaminieren und Viren können indirekt übertragen werden. Um das Überlebenspotenzial des Virus zu verstehen, wurden die Virustiter des bovinen Coronavirus (BCoV) als Modellvirus und von SARS-CoV-2 auf porösen und nichtporösen Oberflächen gemessen. Die Menge des gewonnenen infektiösen BCoV blieb auf nicht porösen Substraten relativ hoch. Auf mehreren nicht porösen Oberflächen wie Nitrilkautschuk nahm die Wirkung jedoch schnell ab. Die Zeit bis zum Erreichen der Nachweisgrenze war bei Vliesmasken als porösem Substrat länger als bei nicht porösen Substraten. Auf anderen porösen Substraten als Vliesmasken nahm die Menge des wiederhergestellten Virus schnell ab und blieb dann auf einem niedrigen Niveau. Repräsentative Substrate wurden mit SARS-CoV-2 getestet. Der Rückgang der Menge an wiedergewonnenen infektiösen Viren war ähnlich wie bei BCoV, obwohl der Rückgang bei SARS-CoV-2 schneller war. Von SARS-CoV-2 abgeleitete RNA wurde ebenfalls mittels Echtzeit-PCR nachgewiesen und blieb auf allen Substraten viel länger auf Oberflächen als infektiöse Viren. Daher ist es wichtig, den Virustiter zu messen, um eine Überschätzung der Kontamination mit infektiösen Viren in der Umgebung zu vermeiden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Oberflächenstruktur nicht direkt mit der Überlebensfähigkeit des Virus zusammenhängt.

Bei viralen Atemwegsinfektionen erfolgt die Übertragung des Virus häufig durch Direktübertragung. Für die direkte Übertragung sind Atemtröpfchen und Aerosole erforderlich, die durch Husten, Niesen und Gespräche entstehen. Es wird auch angenommen, dass Atemwegsviren indirekt1 durch Viren übertragen werden können, die sich auf der Oberfläche verschiedener Materialien ablagern. Im Fall von COVID-19 haben Untersuchungen in Krankenhäusern und auf Kreuzfahrtschiffen das Vorhandensein des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) auf verschiedenen Oberflächen ergeben, mit denen Patienten in Kontakt kamen, wie z. B. Türklinken und TV-Fernbedienungen Bedienelemente, Telefone, Böden und Bettwäsche2,3. SARS-CoV-2-Partikel auf den Oberflächen verschiedener Materialien könnten daher eine Infektionsquelle sein, eine Hypothese, die durch mehrere epidemiologische Studien gestützt wurde4,5. Entscheidend für die indirekte Übertragung sind die Virusmenge auf einer Oberfläche und die Zeitspanne, die Viren auf Materialien überleben.

Verschiedene Faktoren wie relative Luftfeuchtigkeit, Temperatur und die Oberflächeneigenschaften eines Materials beeinflussen die Menge an infektiösem Virus, die von einer Oberfläche zurückgewonnen werden kann. Die Rückgewinnung von infektiösem SARS-CoV-2 von den Oberflächen verschiedener Materialien wurde von mehreren Gruppen6,7,8,9,10 mit unterschiedlichen Ergebnissen untersucht. Diese Unterschiede können auf Unterschiede in den Versuchsbedingungen zurückzuführen sein. Die relative Luftfeuchtigkeit und Temperatur beeinflussen die Verdunstung von Flüssigkeiten, die Viruspartikel enthalten. In Bezug auf die Oberflächenstruktur oder Rauheit haben frühere Forscher die Begriffe „porös“ oder „nicht porös“ verwendet, um sich auf die Oberflächen von Materialien zu beziehen, was auf eine raue bzw. grobe bzw. glatte Textur der Oberfläche hinweist. Da poröse Materialien wie Papier und Vliesmasken zahlreiche Rillen und Zwischenräume aufweisen, absorbieren sie Flüssigkeit und fangen Substanzen in der Flüssigkeit ein. Im Gegensatz dazu kann nicht poröses Material keine Flüssigkeit aufnehmen. Die Oberflächeneigenschaften eines Materials haben daher großen Einfluss auf die Virusmenge, die von einer Oberfläche zurückgewonnen werden kann. Obwohl in früheren Studien dieselben Materialien verwendet wurden, darunter Kunststoff und Glas, haben die Autoren die Details der Substrate, wie z. B. die Arten von Kunststoffen, Metallen und Holz, oder die Eigenschaften der Oberflächen dieser Substrate nicht beschrieben. Sofern in den Studien keine Materialien mit ähnlichen Eigenschaften verwendet werden, werden die Ergebnisse variieren. Frühere Studien haben hauptsächlich nichtporöse Materialien untersucht, und es gibt nur wenige Daten zu porösen Materialien. Allerdings kommen Menschen im täglichen Leben ständig mit porösen Materialien wie Masken, Geldscheinen, Holz, Kleidung und Papier in Kontakt. Neben der Oberflächenstruktur oder -rauheit können auch andere Faktoren an der Virusrückgewinnung aus Substraten beteiligt sein.

In früheren Studien wurde SARS-CoV-2 entweder durch die Infektion kultivierter Zellen oder durch den Nachweis des Vorhandenseins viraler RNA nachgewiesen. Die Infektion kultivierter Zellen weist direkt auf das Vorhandensein eines infektiösen Virus hin, der Nachweis von RNA spiegelt jedoch das Vorhandensein sowohl eines infektiösen als auch eines nichtinfektiösen Virus wider. Daher kann es zu Diskrepanzen zwischen der Erholungszeit des infektiösen Virus, gemessen an der Infektiosität, und der Erholungszeit, gemessen am Vorhandensein viraler RNA, kommen.

Um diese Probleme anzugehen, haben wir verschiedene Substrate bekannter Herkunft vorbereitet und ihre Oberflächenrauheit gemessen. Wir haben das Virus sowohl durch die Infektion kultivierter Zellen als auch durch das Vorhandensein viraler RNA nachgewiesen. Experimente mit SARS-CoV-2 sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe (BSL) 3 durchgeführt werden. Um die Untersuchung einer Vielzahl unterschiedlicher Oberflächen zu ermöglichen, verwendeten wir zunächst das in einem BSL2-Labor behandelte bovine Coronavirus (BCoV) als Ersatz für SARS-CoV-2. Dieses Virus gehört zur Gattung Betacoronavirus, ebenso wie SARS-CoV-2. Frühere Studien haben auf der Grundlage der molekularphylogenetischen Analyse gezeigt, dass BCoV eine der Spezies ist, die am engsten mit SARS-CoV-211 verwandt ist. Nachdem wir die Oberflächen in mehrere Kategorien eingeteilt hatten, untersuchten wir die Überlebensfähigkeit von SARS-CoV-2 auf den Oberflächen repräsentativer charakterisierter Materialien.

Die Oberflächenrauheit jedes repräsentativen Substrats wurde gemessen und als 3D-Mikroskopbilder angezeigt (Abb. 1). Die mikroskopischen Beobachtungen zeigten signifikante Strukturunterschiede in 3D-Bildern zwischen nichtporösen und porösen Substraten im 100-μm-Maßstab. Die Flächenrauheit (Sa; gemessen in µm) drückt als absoluten Wert den Höhenunterschied jedes Punktes im Vergleich zum arithmetischen Mittel der Oberfläche aus. Diese Werte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Werte von Sa auf nicht porösen Substraten betrugen 0,040 für Floatglas, 0,087 für Acrylharz, 0,101 für Polypropylen, 0,102 für Polystyrol, 0,113 für Messing und Polyethylen niedriger Dichte, 0,131 für Keramikfliesen. 0,150 für weiches Polyvinylchlorid, 0,167 für Edelstahl, 0,295 für Melaminharz und 0,458 für Nitrilkautschuk. Die Sa-Werte auf porösen Substraten betrugen 3,34 für Kopierpapier, 8,19 für Polyestergewebe und 12,0 für Lauan-Furnier. Sa war für die Vliesmaske strukturell nicht messbar.

Mikroskopische Beobachtung und 3D-Bilder der Oberfläche von Substraten (20-fache Vergrößerung), die in dieser Studie untersucht wurden. Tafel (a) und (b), links: mikroskopische Beobachtung; rechts: 3D-Bilder auf Oberflächen von Vertretern nichtporöser bzw. poröser Substrate, die in dieser Studie untersucht wurden. Panel (c), links: Aussehen und Querschnittsstruktur der Vliesmaske, rechts: mikroskopische Betrachtung von zwei Schichten der Vliesmaske. Das 3D-Bild der Vliesmaske konnte nicht aufgenommen werden, da ihre Struktur zu tief war.

Zunächst wurde die Virusrückgewinnung aus Substraten anhand des Infektionstiters von BCoV als Ersatz für SARS-CoV-2 gemessen. Die Rückgewinnung infektiöser Viren von mit BCoV inokulierten Oberflächen ist in Abb. 2 dargestellt. Die Nachweisgrenze (LoD) im Virustiter-Assay wurde mit 0,4 log10 TCID50/ml bestimmt. Aufgrund der Zytotoxizität der höchsten Virusverdünnung, die aus Flüssigkeiten aus Messing, Nitrilkautschuk und Lauan-Furnier gewonnen wurde, wurde die LoD auf 1,4 log10 TCID50/ml festgelegt. Unter Verwendung der Steigungen der Linie der besten Anpassung, wie in Abb. 2 dargestellt, wurde die Zeit bis zum LoD bei einer Nachweisgrenze von 1,0 log10 TCID50 als Indikator für die Virusinfektiosität berechnet, wobei auf der Grundlage ähnlicher Studien ein linearer Rückgang der Viruswiederherstellung angenommen wurde7. 12 für alle Substrate (Tabelle 2). Bei nicht porösen Substraten betrugen die Zeiten bis zur LoD 35 Stunden für Floatglas, 81 Stunden für Acrylharz, 62 Stunden für Polypropylen, 48 Stunden für Polystyrol, 4 Stunden für Messing, 65 Stunden für Polyethylen niedriger Dichte und 22 Stunden für Keramik Fliesen, 7 Stunden für weiches Polyvinylchlorid, 29 Stunden für Edelstahl und 25 Stunden für Melaminharz. Die Zeit bis zur LoD für Nitrilkautschuk wurde nicht berechnet, da die beste Anpassungslinie ohne Virustiter an mehr als zwei Punkten nicht gezogen werden konnte. Bei nicht porösen Substraten betrugen die Zeiten bis zur LoD 126 Stunden für Kopierpapier, 39 Stunden für Polyestergewebe und 50 Stunden für die Vliesmaske. Die Zeit bis zur LoD für Lauan-Furnier konnte nicht berechnet werden, da die beste Anpassungslinie ohne Virustiter an mehr als zwei Punkten nicht gezogen werden konnte. Die getesteten Substrate wurden entsprechend dem Grad der Rückgewinnung infektiöser Viren auf der Oberfläche in fünf Gruppen eingeteilt: (1) Floatglas, Acrylharz, Polypropylen, Polystyrol und Polyethylen niedriger Dichte mit hoher Rückgewinnung infektiöser Viren auf nichtporösen Oberflächen Oberflächen; (2) Keramikfliesen, Edelstahl und Melaminharz mit mäßiger Wiederfindung infektiöser Viren auf nicht porösen Oberflächen; (3) Messing, weiches Polyvinylchlorid und Nitrilkautschuk mit geringer Rückgewinnung infektiöser Viren auf nicht porösen Oberflächen; (4) Vliesmasken mit hoher Rückgewinnung infektiöser Viren auf porösen Oberflächen; und (5) Kopierpapier, Polyestergewebe und Lauan-Furnier mit geringer Rückgewinnung infektiöser Viren auf porösen Oberflächen.

Wiederherstellung des infektiösen BCoV-Virus auf allen Substratoberflächen. Die infektiösen BCoV-Titer auf Substratoberflächen wurden als TCID50/ml in dreifacher Ausfertigung 0, 3, 6 und 18 Stunden nach der Inokulation unter Verwendung einer HRT-18G-Zellkultur in 96-Well-Platten gemessen. Proben bei 0 h wurden unmittelbar nach dem Trocknen gemessen. Die Tafeln A und B zeigen nichtporöse bzw. poröse Substrate. Die Rauten geben die mittleren Titer des inokulierten Virus an. Die Kreise geben die mittleren Titer der gemessenen Infektionstiter an. Die Kreuzmarkierungen zeigen an, dass in dreifacher Ausfertigung kein Nachweis (ND) vorliegt. Während der Tests zeigten A-5) Messing, A-11) Nitrilkautschuk und B-3) Lauan-Furnier Zytotoxizität, wobei das gesammelte Virus bei Verwendung unverdünnter Sammlungen HRT-18G-Zellen ohne Virus abtötete. Bei der Berechnung eines Mittelwerts wurde ND mit 0 TCID50/ml für nicht zytotoxische Materialien und 1 log10 TCID50/ml für zytotoxische Materialien angenommen. Die LoD und die gepunkteten Linien geben die Nachweisgrenze der Tests (LoD) bei 0,4 log10 TCID50/ml für nicht zytotoxische Materialien und 1,4 log10 TCID50/ml für zytotoxische Materialien an. Die Zahlen in Klammern neben den Markierungen einschließlich der Daten unter LoD geben die Häufigkeit über LoD in dreifacher Ausfertigung an. Die Balken geben die Standardabweichungen des inokulierten oder gesammelten Virus an. Die fett gedruckten Linien geben die rückläufige Virusrate an, berechnet mittels linearer Regression.

Aus jeder der fünf getesteten Substratgruppen wurde ein Substrat ausgewählt, nach dem Grad der BCoV-Lebensfähigkeit klassifiziert: Polystyrol, Keramikfliesen, weiches Polyvinylchlorid, Kopierpapier und Vliesmaske, und für weitere Experimente mit SARS-CoV verwendet. 2. Die Wiederfindung infektiöser Viren von den mit SARS-CoV-2 beimpften Oberflächen ist in Abb. 3 dargestellt. Aus den Steigungen der Linien der besten Anpassung in Abb. 3 wurde die Zeit bis zur LoD mit einer Nachweisgrenze von 1,0 log10 TCID50 berechnet /ml für alle Substrate, und diese Werte sind in Tabelle 2 aufgeführt. Bei nicht porösen Substraten betrugen die Zeiten bis zur LoD 18 Stunden für Polystyrol, 11 Stunden für Keramikfliesen und 3 Stunden für weiches Polyvinylchlorid. Bei nicht porösen Substraten betrug die Zeit bis zur LoD für die Vliesmaske 19 Stunden. Die am besten geeignete Linie für Kopierpapier war aufgrund ihrer Steigung nicht anwendbar. Unsere Ergebnisse zeigten, dass auf den nicht porösen Oberflächen die Viruslebensfähigkeit auf Polyethylen am höchsten, auf Keramikfliesen mäßig und auf weichem Polyvinylchlorid am niedrigsten war. Auf den porösen Oberflächen war die Viruslebensfähigkeit auf Vliesmasken höher und auf Kopierpapier niedriger.

Rückgewinnung des infektiösen SARS-CoV-2-Virus von allen Oberflächen von Substraten. Die infektiösen Titer von SARS-CoV-2 wurden als TCID50/ml dreifach 0, 3, 6, 12 und 24 Stunden nach der Inokulation unter Verwendung von VeroE6/TMPRSS2-Zellkulturen in 96-Well-Platten gemessen. Proben bei 0 h wurden unmittelbar nach dem Trocknen gemessen. Die linke und rechte y-Achse geben den Infektionstiter (log10 TCID50/ml) bzw. die RNA-Kopienzahl (log10 RNA-Kopien/ml) des Virus an. Die geschlossenen roten und offenen blauen Rauten geben die mittleren Titer bzw. die RNA-Kopienzahl des inokulierten Virus an. Die geschlossenen und offenen Kreise geben die mittleren Titer der gemessenen Infektionstiter bzw. die mittleren RNA-Kopienzahlen des Virus an. Die Kreuzmarkierungen zeigen dreifachen Nachweis (ND) an. Bei der Berechnung eines Mittelwerts wurde ND mit 0 TCID50/ml angenommen. Horizontale dünne und gepunktete Linien bedeuten die Nachweisgrenze der Assays (LoD) bei 0,6 log10 TCID50/ml für den Virustiter bzw. 4,8 log10 RNA-Kopien/ml für die RT-PCR. Die Zahlen in Klammern neben den Punkten einschließlich der Daten unter LoD geben die Häufigkeit über LoD in dreifacher Ausfertigung an. Die Balken geben die Standardabweichungen des inokulierten oder gesammelten Virus an. Die gebrochenen Linien und dicken Linien zeigen die abnehmende Virusrate an, berechnet mithilfe der linearen Regression.

Die beiden Viren hatten gemeinsame Merkmale; Die Virusrückgewinnung nur auf Kopierpapieroberflächen war bei T = 0 deutlich um etwa 4 log10 TCID50/ml reduziert. Darüber hinaus verglichen wir die abnehmenden Raten von SARS-CoV-2 und BCoV auf Polystyrol, Keramik, weichem Polyvinylchlorid und nicht -gewebte Maske unter Verwendung des zweiseitigen T-Tests mit paarweisen Stichproben; SARS-CoV-2 und BCoV zeigten im Vergleich der sinkenden Raten keine Signifikanz (p = 0,1015).

Die Kopienzahlen der SARS-CoV-2-RNA auf den Oberflächen jedes Substrats wurden mittels Echtzeit-RT-PCR quantifiziert (Abb. 3). Das Inokulum enthielt 8,2 log10-RNA-Kopien/ml und die verbleibende Anzahl an SARS-CoV-2-RNAs nahm mit der Zeit auf allen fünf Substraten ab. Die Viruskopienzahl verringerte sich nach 0 h auf Kopierpapier stark von 8,2 auf 5,6 log10 RNA-Kopien/ml. Die LoD in diesem RT-PCR-Assay betrug 4,8 log10 RNA-Kopien/ml (Tabelle 2) und wurde nach 145, 78, 36, 64 und 129 Stunden auf Polystyrol, Keramikfliesen, weichem Polyvinylchlorid, Kopierpapier und nicht erreicht -gewebte Maske bzw. RNA-Rückstände von SARS-CoV-2 auf der Oberfläche blieben 7–12-mal länger als die infektiösen Titer.

Mehrere Forscher haben berichtet, dass von Patienten stammende pathogene Viren wie das Influenzavirus, SARS-CoV und SARS-CoV-21,2,13,14 an den Oberflächen von Haushaltsgegenständen in ihrer Umgebung haften und infektiöse Viren zurückgewonnen werden können . Angesichts des möglichen Infektionsrisikos durch das Anhaften von SARS-CoV-2 an den Oberflächen von Gegenständen, die von vielen Menschen berührt werden, ist es wichtig, die Dauer der Ansteckungsfähigkeit quantitativ zu bewerten.

Wir haben eine umfassende Bewertung durchgeführt, die sich auf die Wiederherstellung von infektiösem BCoV und SARS-CoV-2 von verschiedenen Oberflächen konzentrierte. In Tabelle 3 wird die Wiederherstellung in drei Typen eingeteilt. „Hohe Erholung und Erhaltung“ bedeutet, dass die Erholung des infektiösen Virus von der Oberfläche 0 Stunden nach dem Trocknen des viralen Inokulums auf einem hohen Niveau war und dass das infektiöse Virus über einen relativ langen Zeitraum erhalten blieb. Der Typ „schnell abnehmend“ bedeutet, dass die Erholung des infektiösen Virus von der Oberfläche 0 Stunden nach dem Trocknen des viralen Inokulums nicht stark zurückging, das infektiöse Virus jedoch sofort inaktiviert wurde, oder dass die Erholung des infektiösen Virus von der Oberfläche bei 0 h lag h nach dem Trocknen des viralen Inokulums wurde deutlich verringert und das infektiöse Virus wurde sofort inaktiviert. Der Typ „Auf niedrigem Niveau halten“ bedeutet, dass die Erholung des infektiösen Virus von der Oberfläche 0 Stunden nach dem Trocknen des Virusinokulums deutlich abnahm und dann sehr lange auf einer niedrigen Konzentration aufrechterhalten wurde.

In dieser Studie untersuchten wir die Gewinnung von infektiösem BCoV aus 15 Substraten. Der Sa der in dieser Studie gemessenen nichtporösen Substrate lag im Bereich von 0,040 bis 0,458 μm (Tabelle 1). Es gab keine Korrelation zwischen Sa und der Wiederherstellungsrate des infektiösen Virus, was darauf hindeutet, dass die Oberflächenrauheit keinen direkten Einfluss auf die Überlebensfähigkeit des Virus hatte. Der Grad der Erholung von infektiösem BCoV nach der Anheftung an die Oberfläche war bei Substraten mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften unterschiedlich (Abb. 2, Tabelle 2). Beispielsweise war bei metallischen Substraten der Rückgang der Rückgewinnung infektiöser Viren bei Messing deutlich größer als bei Edelstahl. Eine mögliche Erklärung für diese Beobachtung ist die Inaktivierung des Virus durch Kupferionen15. Der Grad der Virusrückgewinnung von den Oberflächen der Kunststoffharzsubstrate 0 Stunden nach dem Trocknen des Virusinokulums war unter den in dieser Studie getesteten Substraten relativ hoch (Tabelle 2; Unterschied des Virustiters zwischen dem Zeitpunkt der Inokulation und 0 Stunden). Daher ist die Fähigkeit dieser Substrate, Viruspartikel zu reduzieren, möglicherweise relativ gering. Dennoch nahm die Menge infektiöser Viren auf Nitrilkautschuk und weichem Polyvinylchlorid schneller ab als auf anderen Kunststoffharzsubstraten. In Nitrilkautschuk und weichem Polyvinylchlorid werden verschiedene Additive verwendet. Es scheint, dass die Lösung dieser Zusatzstoffe wie Weichmacher, Antioxidantien und Vulkanisationsbeschleuniger16,17,18 aus diesen Substraten die Überlebensfähigkeit des Virus beeinträchtigen könnte. Tatsächlich werden Vulkanisationsbeschleuniger vom Thiuram-Typ (z. B. Tetramethylthiuramdisulfid) auch als Fungizide verwendet19, und es wurde auch berichtet, dass Nitrilkautschuk biozide Wirkung hat20. Daher bewerteten wir den Trend der Erholung infektiöser Viren auf Messing, weichem Polyvinylchlorid und Nitrilkautschuk als „rasch abnehmend“ (Tabelle 3).

In Bezug auf poröse Substrate, mit Ausnahme der Vliesmaske, betrugen die Unterschiede in den Virustitern zwischen dem Zeitpunkt der Virusinokulation und 0 Stunden nach dem Trocknen des Fläschchen-Inokulums auf den Oberflächen von Kopierpapier, Polyestergewebe und Lauan-Furnier 3,0. 3,3 bzw. 3,7 (Tabelle 2). Diese Unterschiede waren viel größer als bei nicht porösen Materialien, mit Ausnahme von Nitrilkautschuk, und die Virusrückgewinnung sank sofort auf ein sehr niedriges Niveau. Allerdings waren die Steigungen der Linien der besten Anpassung der Änderung der SARS-CoV-2- und BCoV-Titer auf diesen porösen Substraten größer als die anderer Substrate, einschließlich der in dieser Studie getesteten nichtporösen Substrate. Infektiöses BCoV auf Kopierpapier und Polyestergewebe wurde bereits 18 Stunden nach dem Trocknen der Virusimpfung nachgewiesen (Abb. 2), und die Zeit bis zur LoD von BCoV auf Kopierpapier wurde mit 126 Stunden berechnet (Tabelle 2). Die Rückgewinnung infektiöser Viren aus diesen porösen Substraten blieb lange Zeit auf einem niedrigen Niveau. Daher haben wir die Art des Trends zur Erholung des infektiösen Virus auf ihnen als „auf niedrigem Niveau halten“ bewertet (Tabelle 3).

Bei Vliesmasken gab es kleine Unterschiede im Virustiter zwischen dem Zeitpunkt der Inokulation und 0 Stunden nach dem Trocknen des Fläschchen-Inokulums (Tabelle 2). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich das infektiöse Virus auf der Oberfläche der Vliesmasken leichter zurückbilden lässt als auf anderen porösen Substraten wie Polyestergewebe, Lauan-Furnier und Kopierpapier. Viruspartikel konnten auf der Vliesmaske nicht zurückgehalten werden und ließen sich leichter zurückgewinnen als auf den anderen porösen Substraten. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Lücken im Gewebe an der Oberfläche zu grob waren, um das virale Inokulum aufzunehmen (Abb. 1). Die Viruspartikel wurden auf Kopierpapier, Polyestergewebe und Lauan-Furnier nicht mehr sammelbar. Die 3D-Struktur der Substratoberflächen könnte die Viruswiederherstellung beeinflussen. Ein 3D-Bild der Vliesmaske konnte in dieser Studie nicht aufgenommen werden, da die Struktur zu tief war (Abb. 1). In Zukunft wird es notwendig sein, die Beziehung zwischen der Struktur auf makroskopischer Ebene statt auf mikroskopischer Ebene und der Virusaktivität für jede Schicht in Vliesmasken zu untersuchen. Eine andere Erklärung ist, dass Polypropylen, der Rohstoff für Vliesmasken, ein hydrophobes Polymer ist, während Papier und Holz hydrophile Substanzen sind. Der hydrophobe Charakter von Polypropylen hat möglicherweise verhindert, dass das virale Inokulum in den Vliesstoff eindringt.

Daher deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Oberflächenrauheit keinen direkten Einfluss auf die Überlebensfähigkeit des Virus hatte und dass der Grad der Erholung infektiöser Viren von Oberflächen je nach Substrat mit ähnlichen physikalischen Eigenschaften unterschiedlich war. Wir hoffen, in Zukunft die physikalisch-chemischen Eigenschaften zu klären, die den größten Einfluss auf die Viruswiederherstellung haben, indem wir dasselbe Material mit unterschiedlichen Oberflächentexturen, Oberflächenwasserabweisungseigenschaften und Zusatzstoffen verwenden.

Die Zeit bis zum LoD mit SARS-CoV-2 betrug für die Vliesmaske 19 Stunden. Dies war die längste Zeit unter den fünf in dieser Studie getesteten Substraten, einschließlich nicht poröser Substrate wie Polystyrol und Keramikfliesen (Tabelle 2). Daher haben wir die Art des Trends zur Wiederherstellung infektiöser Viren als „hohe Wiederherstellung und Aufrechterhaltung“ bewertet (Tabelle 3). Katsumi et al. zeigten, dass der Titer von SARS-CoV-2 in Nasopharyngealabstrichen von Patienten gelegentlich über 6 log10 TCID50/ml lag21,22. Da die Reduzierung von 3,53 log10 TCID50/ml von SARS-CoV-2 auf der Vliesmaske auf die LoD (0,6 log10 TCID50/ml) 21,5 Stunden dauerte, berechnet aus der Steigung der Linie der besten Anpassung für die Vliesmaske. Maske in dieser Studie (Tabelle 2), würde die Abnahme von 6 log10 TCID50/mL Virus auf der Vliesmaske bis zur Nachweisgrenze 38,3 Stunden dauern. Diese Berechnung weist auf die Möglichkeit hin, dass SARS-CoV-2 auf den von Patienten verwendeten Vliesmasken einen oder zwei Tage überlebt. Die Notwendigkeit der Vorsicht beim Umgang mit gebrauchten Masken liegt auf der Hand. Es besteht jedoch kein direkter Zusammenhang zwischen unseren Ergebnissen und der Wirksamkeit von Vliesmasken bei der Verhinderung der Exposition gegenüber Viruspartikeln aus der Außenluft oder bei der Blockierung der Virusfreisetzung in die Luft aus den Atemwegen der Patienten.

van Kampen et al.21 berichteten, dass die Ausscheidung infektiöser Viren von COVID-19-Patienten bis zu 20 Tage nach Auftreten der Symptome anhält, mit einer durchschnittlichen Dauer von 8 Tagen. Daher besteht die Gefahr der Anhaftung von infektiösen Viren, die von Patienten ausgeschieden werden, an Alltagsgegenständen, die durch Kontaktübertragung Infektionsquellen darstellen könnten. Wir müssen darauf achten, die Oberflächen der Substrate zu desinfizieren, die in unserer Tabelle 3 als „hohe Wiederherstellung und Wartung“ eingestuft sind. Die Zeit bis zur LoD für den Infektionstiter von Polystyrol und Vliesmasken, den Substraten mit der höchsten Wiederherstellungsrate von infektiösem SARS -CoV-2, wurde berechnet, 18 oder 19 Stunden nach dem Trocknen des viralen Inokulums mit einem Virustiter von etwa 4 log10 TCID50/ml (Tabelle 2). Wenn Viren mit einem höheren Titer als diesem an den Oberflächen haften, könnte das infektiöse Virus länger überleben. Diese Beobachtung legt nahe, dass wir bei der Desinfektion von Gegenständen aus diesen Substraten vorsichtig sein sollten.

Die Diskrepanz zwischen dem Nachweis von RNA und der Gewinnung infektiöser Viruspartikel lässt darauf schließen, dass der Verlust der Lebensfähigkeit des Virus auf diesen Substraten viel schneller erfolgte als die Abnahme der RNA-Menge. Daher ist der Nachweis von RNA als Marker für das Vorhandensein eines infektiösen Virus nicht ausreichend. Es wurde bereits zuvor darauf hingewiesen, dass virale RNA auf verschiedenen Oberflächen nachgewiesen wurde, die von SARS-CoV-2-Patienten berührt wurden3,4,5,9. Eine Untersuchung auf einem Kreuzfahrtschiff ergab, dass virale RNA 17 Tage nach dem Verlassen der Patienten nachgewiesen werden konnte3. Wie wir jedoch in dieser Studie gezeigt haben, garantiert der Nachweis viraler RNA nicht die Wiederherstellung infektiöser Viruspartikel. Unsere Berechnung legt nahe, dass SARS-CoV-2 auf Vliesmasken, die von Patienten berührt werden, die Infektiosität möglicherweise nur 38,3 Stunden lang aufrechterhält, wie oben erläutert. Daher kann die Übertragung von SARS-CoV-2 über die Oberflächen von Umweltsubstraten durch den Nachweis von RNA als Marker des Virus verstärkt werden. Um die Übertragung des Virus durch die Umwelt zu verstehen, muss der Unterschied zwischen dem Nachweis viraler RNA und der Gewinnung infektiöser Viruspartikel berücksichtigt werden.

Dieses System von Experimenten zur Bestätigung der allmählichen Abnahme der Erholung infektiöser Viren auf der Oberfläche von Testsubstraten unter Verwendung von BCoV erwies sich als nützliche Alternative zu SARS-CoV-2. Experimente mit SARS-CoV-2 sollten in einem BSL3-Labor durchgeführt werden. BCoV kann jedoch in einem BSL2-Labor gehandhabt werden, sodass Experimente sicher durchgeführt werden können. Es ist wichtig, dass wir ein experimentelles System etabliert haben, das BCoV als Screening-Methode verwendet. Da wir die Dynamik des Überlebens der beiden Viren verglichen und unsere Ergebnisse mit BCoV den gleichen Trend zeigten wie die mit SARS-CoV-2, erwies sich BCoV als wertvolles Modellvirus zum Testen der Wiederherstellung infektiöser SARS- CoV-2 von Oberflächen.

In dieser Studie wurde der BCoV-CS5-Stamm verwendet, der aus einem Nasenabstrich von Rindern mit leichten Atemwegssymptomen in Japan isoliert wurde23. Die Nasenabstrichprobe wurde von klinischen Tierärzten gemäß den Richtlinien für Tierethik der Miyazaki Agricultural Mutual Relief Association zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken mit Zustimmung des Besitzers entnommen. Der Tierarzt an der Universität Miyazaki isolierte den Virusstamm aus der Abstrichprobe mit Genehmigung des Verwaltungsausschusses der Forschungseinheit für Infektionskrankheiten, dem Center for Animal Disease Control. Das SARS-CoV-2; Der Stamm 2019-nCoV JPN/TY/WK-521 wurde vom National Institute of Infectious Diseases in Japan bezogen.

Zur Vermehrung von BCoV wurden HRT-18G-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium High Glucose (DMEM-High Glucose; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), ergänzt mit 10 % FBS (Bovogen Biologicals Pty Ltd., Keilor, Australien), kultiviert ) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum (Thermo Fisher Scientific)23. Die Virus- und Zellkulturen wurden 5 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten und Zellüberstände und Lysate wurden gesammelt. Das Virus wurde durch Ultrazentrifugation unter Verwendung der Saccharose-Dichtegradientenmethode24,25 konzentriert und gereinigt und in destilliertem Wasser in HPLC-Qualität (Kanto Chemical Co., Ltd., Tokio, Japan) suspendiert. Gereinigtes BCoV wurde mit den oben beschriebenen Zusätzen zehnfach in DMEM mit hohem Glucosegehalt verdünnt und in Inokulationsexperimenten auf Oberflächen verwendet.

Zur Vermehrung von SARS-CoV-2 wurden VeroE6/TMPRSS2-Zellen (JCRB 1819) in Dulbecco's Modified Eagle's Medium mit niedrigem Glucosegehalt (DMEM-low Glucose; Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % FBS, 2,5 µg/ml wässrigem G418-Disulfat, kultiviert (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japan) und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum7,26. Nach 5 Tagen bei 37 °C in 5 % CO2 wurden Zellüberstände und Viren gesammelt und zehnfach in DMEM mit niedrigem Glucosegehalt ohne Zusätze verdünnt und in Inokulationsexperimenten auf Oberflächen verwendet.

In dieser Studie wurden die Oberflächen von 15 kommerziell erhältlichen Substraten getestet, die eine Vielzahl von Oberflächen in Wohnumgebungen repräsentieren (Ergänzungstabelle S1). Diese Substrate wurden auf dem Markt gekauft. Ein 5 x 5 cm großes Stück Floatglas, Acrylharz, Polypropylen, Polystyrol, Messing C2801 (Cu 60 %, Zn 40 %), Polyethylen niedriger Dichte, Keramikfliesen, weiches Polyvinylchlorid, Edelstahl SUS430, Melaminharz und Nitril Für die Impftests wurden Gummi und ein poröses Substrat aus Lauan-Furnier verwendet. Für die Impftests wurden drei 1 x 1 cm große Stücke der porösen Substrate Kopierpapier, Polyestergewebe und Vliesmaske aus Polypropylen (einschließlich der gesamten Innen- und Außenschicht) verwendet. Die Proben wurden mit Ethylenoxidgas sterilisiert. Die Experimente wurden für jede Oberfläche dreifach durchgeführt.

Die Flächenrauheit (µm), die als absoluter Wert den Höhenunterschied jedes Punktes im Vergleich zum arithmetischen Mittel der Oberfläche ausdrückt, wurde mit einem VK-X1000 3D-Mikroskop von Keyenece (Osaka, Japan) gemessen. Das Abbildungsfeld betrug 705 µm in der X-Achse und 528 µm in der Y-Achse (20-fache Vergrößerung). Sa wurde als Mittelwert der Messungen an acht nicht überlappenden Beobachtungsflächen auf der Probenoberfläche (n = 8) berechnet.

Bei den Tests mit BCoV wurden Virusinokulationstests mit allen 15 Substraten durchgeführt (Ergänzungstabelle S1). Bei den Tests mit SARS-CoV-2 wurden Virusimpfungstests mit fünf Proben durchgeführt, die anhand der experimentellen Ergebnisse des BCoV ausgewählt wurden; Polystyrol, Keramikfliesen, weiches Polyvinylchlorid, Kopierpapier und Vliesmaske. Der virale Inokulations- und Erholungstest wurde auf diesen Substratoberflächen unter Bezugnahme auf frühere Studien12,27,28 durchgeführt. Ein 5 x 5 cm großes Substratstück oder drei 1 x 1 cm große Substratstücke wurden in eine sterile Petrischale aus Glas gegeben. Sechzig Mikroliter virales Inokulum, aufgeteilt in sechs bis zwölf Flecken, wurden in der Mitte einer Oberfläche aufgetragen. Die Petrischale wurde geöffnet und etwa 60 Minuten lang in einem Sicherheitsschrank trocknen gelassen.

Nach dem Trocknen wurde das Substrat in eine Petrischale aus Glas in einen Inkubator mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit gelegt, der auf 75 % relative Luftfeuchtigkeit und 25 °C eingestellt war (jährliche durchschnittliche Außenluftfeuchtigkeit in Tokio, Japan in den Jahren 2018 und 2019, wie von der Japan Meteorological Agency veröffentlicht). )29. BCoV wurde zu vier Zeitpunkten wiederhergestellt; Zeitpunkt 0 (unmittelbar nach dem Trocknen) und nach 3 Stunden, 6 Stunden und 18 Stunden in 300 µL Tropfen DMEM-hoher Glucose, ergänzt mit 1 % FBS, 1 % Antibiotikum-Antimykotikum und 2,5 µg/ml Pankreatin (Fujifilm Wako Pure). Chemical Corporation, Richmond, VA, USA), indem Sie eine Minute lang auf die Oberfläche pipettieren und so viel Flüssigkeit wie möglich in einem Mikroröhrchen sammeln. SARS-CoV-2 wurde zu fünf Zeitpunkten nachgewiesen; Zeit 0 h (unmittelbar nach dem Trocknen) und nach 3 h, 6 h, 12 h und 24 h, in 300 µL Tropfen DMEM-niedriger Glucose, ergänzt mit 1 % FBS, 2,5 µg/ml G418 und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum indem Sie eine Minute lang auf die Oberfläche pipettieren und so viel Flüssigkeit wie möglich in einem Mikroröhrchen sammeln. Jede Virusgewinnung wurde zweimal auf jeder Oberfläche wiederholt und insgesamt 600 µl Inokulum gesammelt. Die Negativkontrollen bestanden aus denselben Oberflächen ohne vorherige Inokulation des Virus. Der infektiöse Virustiter in einer zu jedem Zeitpunkt gesammelten Erholung wurde verglichen, um die Effizienz der Wiederherstellung infektiöser Viren zu bewerten. Dieses Experiment wurde dreifach wiederholt.

Die Mengen an infektiösem Virus auf allen Oberflächen wurden mittels Endpunkttitration mit einer zehnfachen Reihenverdünnung der Viruswiedergewinnung in DMEM mit den oben beschriebenen Ergänzungen quantifiziert. SARS-CoV-2 wurde auf frische Monoschichten von Zellen (Vero E6/TMPRSS2) in einer 96-Well-Platte geimpft. Die Kultur wurde 4 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten. BCoV wurde auf frische Monoschichten von HRT-18G-Zellen in einer 96-Well-Platte geimpft. Die Kultur wurde 6 Tage lang bei 37 °C in 5 % CO2 gehalten. Nach der Inkubation wurden die Zellen überwacht, um einen virusinduzierten zytopathischen Effekt (CPE) festzustellen. Die Virustiter wurden mit der Reed-Muench-Methode30 berechnet.

Wenn die Titer unterhalb der Quantifizierungsgrenze der Reed-Muench-Methode lagen, wurde der Titerwert geschätzt, indem die Anzahl der Vertiefungen, in denen CPE auftrat, durch die äquivalenten Volumina der unverdünnten Rückgewinnungsflüssigkeit in einem Test dividiert wurde (z. B. 1 CPE-Vertiefung in 0,22222 ml). des äquivalenten unverdünnten Volumens in einem Virustiter-Assay führt zu 0,65 log10 TCID50/ml). Die Zytotoxizität wurde bei der höchsten Verdünnung einer Virusrückgewinnungsflüssigkeit aus drei Arten von Substraten, wie Messing, Nitrilkautschuk und Lauan-Furnier, beobachtet. Mithilfe dieser Schätzung wurde die LoD im Virustiter-Assay zu 0,6 log10 TCID50/ml für SARS-CoV-2, 0,4 log10 TCID50/ml für BCoV mit nicht-zytotoxischen Materialien und 1,4 log10 TCID50/ml für BCoV mit zytotoxischen Substraten bestimmt , wie oben beschrieben. Ein Test ohne CPE wurde als ND gewertet. Für die Berechnung der Mittelwerte und Standardabweichungen der Titer wurde ND als 0 TCID50/ml angenommen. Die abnehmenden Titerlinien wurden durch lineare Regression unter Verwendung der mittleren Titer unter Ausschluss aller ND-Daten zu einem Zeitpunkt berechnet. Für den Vergleich sinkender Raten wurde ein zweiseitiger T-Test bei gepaarten Stichproben mit einem Signifikanzniveau von p < 0,05 durchgeführt.

Virale RNAs wurden aus den SARS-CoV-2-Rückgewinnungen von Oberflächen mithilfe der QIAamp Viral RNA Mini Kits (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die RT-PCR wurde unter Verwendung von One Step PrimeScript RT-PCR-Kits mit Primer/Sonden-Set N2 (Takara Bio, Shiga, Japan)31 durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren: Reverse Transkription für 5 Minuten bei 42 °C, anfängliche Denaturierung für 10 Sekunden bei 95 °C, dann 45 Zyklen von 5 Sekunden bei 95 °C und 30 Sekunden bei 60 °C auf einem Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR-System (Thermo Fisher Scientific). Um die viralen RNA-Kopienzahlen zu quantifizieren, wurde eine Standardkurve unter Verwendung des Positivkontroll-RNA-Mix (2019-nCoV; Takara Bio) erstellt. Die Zeit bis zur LoD für SARS-CoV-2 wurde bei einer Nachweisgrenze von 4,8 log10 RNA-Kopien/ml für alle Substrate berechnet.

Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in diesem Artikel und seinem Zusatzmaterial verfügbar sind.

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Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Maiko Watanabe, Takahiro Ohnishi und Sakura Arai.

Abteilung für Mikrobiologie, National Institute of Health Sciences, Kanagawa, 210-9501, Japan

Maiko Watanabe, Takahiro Ohnishi, Sakura Arai, Katsuhiko Hayashi, Kenji Ohya, Shouhei Hirose, Tomoya Yoshinari und Yukiko Hara-Kudo

Abteilung für Umweltchemie, National Institute of Health Sciences, Kanagawa, 210-9501, Japan

Tsuyoshi Kawakami und Yoshiaki Ikarashi

Labor für Mikrobiologie, Abteilung für Veterinärmedizin, Azabu-Universität, Kanagawa, 252-5201, Japan

Satoshi Taharaguchi

Zentrum für Tierseuchenkontrolle, Universität Miyazaki, Miyazaki, 889-2192, Japan

Hirohisa Mekata

Abteilung für Tierlebenswissenschaften, Institut für Landwirtschaft, Universität für Landwirtschaft und Technologie Tokio, Tokio, 183-8509, Japan

Takahide Taniguchi

National Institute of Health Sciences, Kanagawa, 210-9501, Japan

Masamitsu Honma & Yukihiro Goda

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MW und YH-K. hat die Studie entworfen. MW, TO, SA, TK, KH, KO, SH, TY und YH-K. entwickelte die Technik und führte die Experimente durch. MW, TO, SA, TK, KH, KO, SH, TY, YI und YH-K. analysierte die Daten. MW, TO, SA, TK, KH, KO, HM, YI und YH-K. hat das Manuskript vorbereitet. ST, HM und TT stellten Reagenzien und technische Unterstützung zur Verfügung. MH und YG betreuten das Projekt. MH, YG und YH-K. Fördermittel zur Verfügung gestellt. Alle Autoren stimmten dem Manuskript zu.

Korrespondenz mit Yukiko Hara-Kudo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Watanabe, M., Ohnishi, T., Arai, S. et al. Überleben von SARS-CoV-2 und bovinem Coronavirus auf gemeinsamen Oberflächen von Lebensumgebungen. Sci Rep 12, 10624 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14552-9

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Eingegangen: 25. Februar 2022

Angenommen: 08. Juni 2022

Veröffentlicht: 23. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14552-9

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